耀西︰
加入方法︰遊戲初期便可使用。
角色說明︰這是耀西首次以單獨可操縱的角色登陸正統馬力奧作品，它的特殊能力是吐火，一些藏在冰塊中的星星和金幣只有靠這招才能獲得。另外長長的舌頭能吞下敵人和金幣，吞下敵人不吐出來的話可以生下個蛋，扔出去后能攻擊敵人，有跟蹤連鎖的效果。跳起來后按住B 有一段滯空時間。不過它的缺點是跑地較慢，跳地較低，筆者只是在初期使用了一會兒，獲得其他人物后就很少有出場機會了~~
所有兔子取得地點︰城堡外面有5只，地下室有1只，放完水后城堡外的護城河道上有1只（放水在地下室兩根柱子那，用坐把兩根柱子坐下去后即可放水。
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馬利奧︰
加入方法︰收集到8顆星星，來到進陽光馬利奧關的那間屋子打開那扇需要8顆星星的門，進入馬力奧畫像關，解決B O S S 后就能獲得開啟換馬利奧門的鑰匙。
角色說明︰作為主人公竟然無法在初期使用實數意外，人物能力還是沒變，屬于平均形的，不過根據我觀察，馬利奧是所有角色中跑地最快的，雖然跳地沒路易高，總得來說用起來還是很順手的。其特殊能力是變成胖子馬利奧，能漂浮在空中，很多高處的平台都要靠這招才能到達，另外他還能透過牆壁進行三角跳，這招可是非常實用的。最後要說一下最終庫巴關只有用馬利奧才能順利進入，用其他角色只有無止境的台階。
所有兔子取得地點︰城堡外面有1只，海底關的房間內有1只，地下室裡有2只，放完水后城堡外的護城河道上有1只，二樓上有1只，在瓦裡奧畫像的房間內有1只。
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路易︰
加入方法︰在鬼屋關的閣樓上有個路易的畫像，進入后是個迷宮，將你D S 的音量開大點吧，透過環繞音效能分辨出聲音是從哪扇門裡傳出來的，贊一個﹗裡面有個幽靈王，戰勝后獲得開啟換路易門的鑰匙。
角色說明︰進入3D 時代后路易就只在鬼屋大冒險中露了次臉，果不其然，這次獲得他的地點就是在鬼屋-_-b 。他的特殊能力是透明，主要用處就是來獲得一些關在籠子中的星星。此外路易的特點是跳地最高，而且在空中有滯空時間。他最好用的一招就是后空翻了（按住R 再按A ），雖然這招其他人也會，但他的特色是跳起來后透過在空中的旋轉進行漂浮，透過這招能移動到一些看似很難達到的地點，大大易化了一些星星和紅幣的入手難度。筆者60%的星星都是靠路易獲得的，強烈推薦﹗
所有兔子取得地點︰炸彈關房間有1只，馬利奧畫像房間有1只，城堡庭院裡有1只（在門上面），放水的兩根柱子那有1只，二樓上有1只，城堡外有1只，收集150星后用炮轟到城堡頂上有1只（嚴重B S 這個設定﹗）。
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瓦裡奧︰
加入方法︰到達城堡二樓，來到一個有面大鏡子的房間，使用路易進去會出現花，利用透明穿過鏡子進入瓦裡奧畫像，解決B O S S 后獲得開啟換瓦裡奧門的鑰匙。
角色說明︰瓦裡奧大人憑借最近的人氣閃亮登陸馬力奧64D S 。他的特殊能力是變成金屬人，無敵+在水中不會漂浮，透過這個能獲得一些在水中的星星和紅幣。瓦裡奧的特點是力量最大，所有角色中只有他能打破黑色的磚塊，不少星星和紅幣都要透過這個才能獲得，另外那些木樁別人要坐三次才能坐下去，而他只要坐一次便能搞定。不過此人的致命弱點是移動速度和跳躍高度是所有角色中最低的，用起來極度不順手，基本上只有到要獲得一些透過他的特殊能力才能得到的星星時才會選他出場，平時都是封印狀態……
有兔子取得地點︰地下室有1只，空中堡壘關房間裡有1只，二樓另外扇門裡有1只，鐘樓上有2只，城堡外有1只，城堡庭院裡有1只
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第1關~~炸彈關︰
1︰爬上山頂，干掉炸彈王后獲得（吞下小炸彈再吐向炸彈王）
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